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標(biāo)題：FOXC1-mediated LINC00301 facilitates tumor progression and triggers an immune-suppressing microenvironment in non-small cell lung cancer by regulating the HIF1α pathway.

期刊：Genome Medicine

影響因子：10.675

關(guān)鍵詞：lncRNA，LINC00301，HIF1α，F(xiàn)OXC1，非小細(xì)胞肺癌

主要技術(shù)方法：RNA免疫共沉淀（RIP-qPCR），RNA pull down，EMSA，F(xiàn)ISH，染色免疫共沉淀（ChIP-qPCR），雙熒光素酶報告基因等。

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)仍然是全球癌癥死亡的主要誘因之一，長鏈非編碼RNA(LncRNA)在多種癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起著非常復(fù)雜的作用，可以作為預(yù)后或診斷的標(biāo)志物。LINC00301在肺癌中的表達(dá)水平超過正常組織5倍多，但其在NSCLC中的詳細(xì)分子機(jī)制仍不清楚。

2020年12月，武漢大學(xué)健康學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系的研究人員發(fā)現(xiàn)NSCLC中高表達(dá)的LINC00301與不良預(yù)后密切相關(guān)。體外實驗表明LINC00301促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，抑制細(xì)胞周期阻滯和凋亡。體內(nèi)實驗表明LINC00301靶向TGF-β募集Treg細(xì)胞，減少CD8+T細(xì)胞，發(fā)揮免疫抑制作用，增加致瘤性。從機(jī)制上講，轉(zhuǎn)錄因子FOXC1促進(jìn)LINC00301表達(dá)，LINC00301直接結(jié)合EZH2并增加EAF2啟動子的H3K27me3修飾，進(jìn)而調(diào)節(jié)EAF2/VHL/HIF1α途徑促進(jìn)NSCLC發(fā)展。此外，他們還發(fā)現(xiàn)LINC00301可作為“miRNA海綿”通過miR-1276-HIF1α信號軸發(fā)揮作用。

1.    LINC00301在NSCLC中高表達(dá)并促進(jìn)腫瘤發(fā)展
數(shù)據(jù)庫顯示LINC00301在NSCLC中顯著上調(diào)，120對臨床樣本的qRT-PCR檢測確定了LINC00301在NSCLC顯著上調(diào)，且與更差的預(yù)后有關(guān)。克隆形成、CCK8、Transwell、流式細(xì)胞檢測等實驗表明，過表達(dá)LINC00301可顯著促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞周期阻滯和凋亡。小鼠移植瘤實驗表明，LINC00301過表達(dá)導(dǎo)致腫瘤增大，移植瘤中Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)量增加，表明LINC00301顯著促進(jìn)了致瘤性。接下來，研究者通過質(zhì)譜流式細(xì)胞（CyTOF）和免疫熒光技術(shù)分析了LINC00301在小鼠腫瘤免疫細(xì)胞浸潤中的作用，發(fā)現(xiàn)LINC00301抑制CD8+T細(xì)胞的浸潤，促進(jìn)CD+4 CD+25Treg細(xì)胞的浸潤，提示LINC00301通過募集Treg細(xì)胞在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮免疫抑制作用，或許可以作為識別ICI療效的標(biāo)志物。已知TGF-β1誘導(dǎo)CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞的形成，作者檢測發(fā)現(xiàn)，NSCLC細(xì)胞上清液中的TGF-β1水平高于正常，而LINC00301過表達(dá)又進(jìn)一步增加了TGF-β1水平，表明LINC00301可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞分泌TGF-β1，驅(qū)動Treg細(xì)胞浸潤，進(jìn)而抑制腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞的數(shù)量。

2.    轉(zhuǎn)錄因子FOXC1調(diào)控LINC00301表達(dá)
為了確定LINC00301受哪些因素調(diào)控，首先檢測了染色質(zhì)甲基化和脫乙?；@兩類可以沉默或激活基因表達(dá)的因素，但發(fā)現(xiàn)它們并不參與對LINC00301的調(diào)控。接著在線預(yù)測了可能與LINC00301啟動子結(jié)合的潛在轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)FOXC1在NSCLC中表達(dá)上調(diào)。熒光素酶報告分析與染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實驗結(jié)果表明，F(xiàn)OXC1介導(dǎo)了NSCLC中LINC00301的上調(diào)。

3.    LINC00301招募EZH2到EAF2啟動子并抑制其表達(dá)
FISH結(jié)果顯示LINC00301在細(xì)胞核中的含量顯著高于細(xì)胞質(zhì)，推測LINC00301可能參與組蛋白甲基化。檢測發(fā)現(xiàn)，LINC00301可特異性的增加H3K27二/三甲基化。H3K27二/三甲基化通常由PRC2催化，LINC00301的RNA免疫沉淀法(RIP)確定了PRC2元件“EZH2”和“SUZ12”被顯著富集。RNA pull-down實驗進(jìn)一步證實，LINC00301在NSCLC細(xì)胞中與EZH2結(jié)合，但不與SUZ12結(jié)合。RNA pull down和RNA EMSA實驗確定了LINC00301的83-123nt區(qū)域直接與EZH2的612–727 aa區(qū)域結(jié)合。對EZH2下游靶標(biāo)的檢測發(fā)現(xiàn)，LINC00301過表達(dá)顯著抑制了EAF2的mRNA和蛋白水平。ChIP-qPCR也確定了EZH2可以直接與EAF2啟動子區(qū)結(jié)合。這些結(jié)果表明：在NSCLC中，LINC00301結(jié)合并招募EZH2到EAF2啟動子，增加EAF2啟動子H3K27me3來抑制其表達(dá)。臨床數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步證實了EAF2對NSCLC有抑制作用。

4.    LINC00301通過調(diào)節(jié)EAF2/VHL/HIF1α途徑促進(jìn)NSCLC發(fā)展
已知EAF2可以結(jié)合并穩(wěn)定pVHL，進(jìn)而促進(jìn)HIF1α降解，保護(hù)細(xì)胞免受缺氧引發(fā)的細(xì)胞死亡。為了確定LINC00301是否參與這一過程，作者進(jìn)行了過表達(dá)/干擾實驗。結(jié)果顯示，LINC00301顯著抑制了EAF2和pVHL蛋白表達(dá)，增加了HIF1α蛋白表達(dá)。細(xì)胞實驗表明，LINC00301的表達(dá)和EAF2的敲除加速了NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，臨床樣本檢測發(fā)現(xiàn)，HIF1α在NSCLC中的水平顯著高于正常組織，數(shù)據(jù)庫分析表明高水平的HIF1α與改善的總生存期和無進(jìn)展生存期顯著相關(guān)。

5.    LINC00301還可作為miR-1276海綿促進(jìn)HIF1α
由于LINC00301也存在于細(xì)胞質(zhì)中，推測其也會通過細(xì)胞質(zhì)途徑發(fā)揮致癌作用。作者預(yù)測了LINC00301的潛在結(jié)合miRNA，并進(jìn)行了RNA pull down實驗，其中miR-1276被顯著富集。雙熒光素酶實驗進(jìn)一步確定了miR-1276可以在預(yù)測位點直接與LINC00301結(jié)合。miRNA靶基因預(yù)測提示HIF1α可能是miR-1276的潛在靶標(biāo)，雙熒光素酶實驗確認(rèn)了這一結(jié)果。對臨床樣本的檢測表明，miR-1276不影響HIF1α的RNA水平，但抑制其蛋白水平。進(jìn)一步的實驗表明，LINC00301對HIF1α的促進(jìn)作用可被miR-1276抑制，miR-1276對HIF1α的抑制也可因LINC00301加入而減輕；miR-1276通過直接靶向HIF1α抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。這些結(jié)果表明LINC00301的致癌功能和效率至少部分歸因于miR-1276-HIF1α信號軸。

本研究闡明了LINC00301對NSCLC致癌作用的潛在機(jī)制，并揭示了LINC00301可能是一個有價值的生物標(biāo)志物和可能的治療靶點。