基因組革命揭示了疾病相關(guān)基因的環(huán)境。 詢問蛋白質(zhì)的功能更加困難。 測(cè)量蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用如何響應(yīng)細(xì)胞的擾動(dòng)而變化——使用化學(xué)物質(zhì)或調(diào)整基因可以揭示對(duì)在特定疾病中起作用的蛋白質(zhì)的見解。

量化蛋白質(zhì)相互作用

蛋白質(zhì)不會(huì)單獨(dú)作用。它們通常與其他蛋白質(zhì)一起進(jìn)行切片和切塊并催化反應(yīng)。了解這種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或 PPI，有助于探究一個(gè)基因的突變?nèi)绾斡绊懙鞍踪|(zhì)如何相互“交談”以驅(qū)動(dòng)疾病。

科學(xué)家通常一次只測(cè)量一種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。 在一個(gè)緩慢而費(fèi)力的過程中，他們抓住一種蛋白質(zhì)，將其從細(xì)胞中拉出，并繪制出它與哪些蛋白質(zhì)相互作用的圖譜。 定量親和純化質(zhì)譜法或 q-AP-MS 等方法可以以更高的通量測(cè)量蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)在其天然環(huán)境（細(xì)胞）內(nèi)的變化。

在其基本形式中，q-AP-MS 的工作原理如下：細(xì)胞（或整個(gè)動(dòng)物）被“喂食”大量氨基酸，隨著時(shí)間的推移，這些氨基酸會(huì)融入蛋白質(zhì)中。  平行制備其他細(xì)胞作為陰性對(duì)照。   然后用編碼待研究蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞；  蛋白質(zhì)通常用標(biāo)簽進(jìn)行修飾，例如 GFP，以便以后可以輕松分離。   接下來，蛋白質(zhì)從細(xì)胞中切下并穿過凝膠，凝膠中含有與蛋白質(zhì)標(biāo)簽結(jié)合的抗體。  蛋白質(zhì)被切割成更小的片段，一切都通過質(zhì)譜儀運(yùn)行。   結(jié)果是哪些蛋白質(zhì)與所選蛋白質(zhì)結(jié)合的定量快照。

然而，在過去幾年中，其他方法彌補(bǔ)了與 q-AP-MS 相關(guān)的一些缺點(diǎn)。 一方面，將標(biāo)簽融合到感興趣的蛋白質(zhì)上可以從根本上改變蛋白質(zhì)的行為方式。 該方法還僅提供一個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中 PPI 的快照，并且該方法偏向于強(qiáng)相互作用的蛋白質(zhì)； 瞬態(tài)連接更難檢測(cè)和測(cè)量。 

解決 PPI 問題

“多年來，AP-MS 實(shí)驗(yàn)依賴于用相對(duì)較大的熒光蛋白 GFP 和/或其異源過度表達(dá)標(biāo)記蛋白質(zhì)，”ChromoTek 高級(jí)科學(xué)家兼研發(fā)分析團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人 Christian Linke-Winnebeck 說，這是 Proteintech Group 的一部分。   “當(dāng)然，雖然這種方法已經(jīng)產(chǎn)生了很多知識(shí)，但感興趣的蛋白質(zhì)可能仍然受到龐大標(biāo)簽和高于正常表達(dá)水平的影響?！?

這就是為什么實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在不使用 GFP 標(biāo)記，而是使用 CRISPR 直接標(biāo)記基因組中的基因，以避免干擾基因的表達(dá)水平。 3 Linke-Winnebeck 說，其他團(tuán)體也在使用“分裂熒光蛋白”來標(biāo)記蛋白質(zhì)。 在這種情況下，“只有一小部分熒光蛋白與您感興趣的蛋白質(zhì)融合，其余部分在單獨(dú)的質(zhì)粒上表達(dá)，”他說。 “僅使用一個(gè)小片段使 CRISPR-Cas 內(nèi)源性標(biāo)記方法的工作變得更加容易，”因?yàn)槭褂?CRISPR 插入大基因可能很困難。

在最近的預(yù)印本中，一家德國(guó)實(shí)驗(yàn)室正是使用這種方法“用熒光蛋白 mNeonGreen 的片段標(biāo)記人類細(xì)胞系中的 1,300 多個(gè)內(nèi)源基因，”Linke-Winnebeck 說，然后分裂開細(xì)胞并使蛋白質(zhì)通過一種含有高親和力抗體片段或納米抗體的特殊凝膠，用于 mNeonGreen，由 ChromoTek 作為 MNeonGreen-Trap 出售。  “這允許在自然環(huán)境中對(duì) 1,300 種蛋白質(zhì)進(jìn)行可視化和深入分析。”

為了實(shí)時(shí)跟蹤 PPI，并收集超出時(shí)間快照的數(shù)據(jù)，科學(xué)家們轉(zhuǎn)向了 q-AP-MS 之外的方法。 一種稱為 BRET（生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移），使用光來檢測(cè)相互作用的蛋白質(zhì)。 一種蛋白質(zhì)與熒光素酶（其作用類似于電子供體）融合，而另一種蛋白質(zhì)與熒光蛋白融合，作為受體。 當(dāng)兩者靠近時(shí)，電子從供體轉(zhuǎn)移到受體，受體發(fā)出熒光。 4 該實(shí)驗(yàn)甚至可以在 384 孔板中平行進(jìn)行，并且可以在大約兩個(gè)小時(shí)內(nèi)測(cè)量熒光。

這可以對(duì) PPI 進(jìn)行實(shí)時(shí)的動(dòng)力學(xué)分析，從而更透徹地了解 PPI 動(dòng)態(tài)以及它可能如何不同，例如，在化合物治療之間或相關(guān)蛋白質(zhì)之間的差異

“這些 PPI 方法通常用于篩選工作，以識(shí)別調(diào)節(jié)目標(biāo) PPI 的新化合物，并且可以輕松適應(yīng)以更好地了解臨床相關(guān)突變?nèi)绾斡绊懠?xì)胞 PPI 及其對(duì)潛在治療干預(yù)的反應(yīng)，”丹尼爾斯說。  并且“因?yàn)檫@些方法允許在天然細(xì)胞環(huán)境中分析蛋白質(zhì)相互作用動(dòng)力學(xué)，所以它們通常用于確認(rèn)生化 PPI 研究的結(jié)果”——例如 q-AP-MS，它需要從細(xì)胞中去除蛋白質(zhì)—— “反映了細(xì)胞內(nèi)實(shí)際發(fā)生的情況。”

為了測(cè)量瞬時(shí)或微弱的蛋白質(zhì)相互作用，科學(xué)家可以使用表面等離子體共振或 SPR，這是一種無標(biāo)記、基于光學(xué)的生物物理方法，其中將少量配體固定在表面上，然后是結(jié)合伙伴，例如作為蛋白質(zhì)，通過微流體流動(dòng)系統(tǒng)引入。 5 當(dāng)兩者結(jié)合時(shí)，反射光強(qiáng)度的變化（由于非?？拷鼈鞲衅鞅砻娴恼凵渎首兓┛捎糜跍y(cè)量結(jié)合在一起的分子的比例。 通過隨時(shí)間測(cè)量，這些數(shù)據(jù)用于計(jì)算結(jié)合親和力和結(jié)合/解離動(dòng)力學(xué)。 通過靈敏度、自動(dòng)化和并行流體的改進(jìn)，現(xiàn)代 SPR 儀器每天可以例行篩選或表征 100 到 1000 次交互。

這種信息豐富的技術(shù)使我們能夠獲得多種類型的信息，包括親和力（相互作用的緊密程度或治療劑與其靶標(biāo)的結(jié)合強(qiáng)度）、動(dòng)力學(xué)（相互作用的速度）、濃度（功能活性產(chǎn)品的數(shù)量）

Belcher 說，這項(xiàng)技術(shù)對(duì)藥物發(fā)現(xiàn)特別有用，因?yàn)榭梢圆⑿泻Y選大型抗體庫(kù)，以了解它們?nèi)绾闻c蛋白質(zhì)結(jié)合。  一旦確定了藥物，SPR 還可以用于在成熟過程中精確跟蹤和測(cè)量其親和力和/或動(dòng)力學(xué)。

測(cè)量 PPI 以促進(jìn)臨床發(fā)現(xiàn)

這三種方法——q-AP-MS、BRET 和 SPR——一起以令人印象深刻的細(xì)節(jié)繪制、測(cè)量和剖析 PPI。  他們還在藥物發(fā)現(xiàn)、基礎(chǔ)和臨床研究方面迎來了一場(chǎng)名副其實(shí)的革命。

在一項(xiàng)研究中，Scripps Research 的研究人員使用串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽（用于更定量和并行化質(zhì)譜的化學(xué)標(biāo)簽）和 AP-MS 來研究稱為 ATF6 的轉(zhuǎn)錄因子如何控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并“命令”它減少數(shù)量一種淀粉樣蛋白，稱為 ALLC，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。 這一發(fā)現(xiàn)加強(qiáng)了我們對(duì)系統(tǒng)性淀粉樣蛋白疾病的理解，例如轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白相關(guān)的淀粉樣蛋白疾病。 

另一項(xiàng)研究使用 AP-MS 一次研究了 7,000 多種蛋白質(zhì)。 研究人員采用 HEK293T 腎細(xì)胞，用 2,594 種不同的“誘餌”轉(zhuǎn)染它們，并使用質(zhì)譜法揭示了 7,668 種蛋白質(zhì)中的 23,744 種相互作用。 7 其他團(tuán)體進(jìn)一步擴(kuò)展了這項(xiàng)工作； 今年早些時(shí)候，不列顛哥倫比亞大學(xué)的一個(gè)團(tuán)隊(duì)在包括心臟和大腦在內(nèi)的七種不同小鼠組織中繪制了超過 125,000 個(gè) PPI。 大多數(shù)相互作用以前沒有報(bào)道過。 8 他們使用了一種有點(diǎn)類似于 q-AP-MS 的技術(shù)，稱為 蛋白質(zhì)相關(guān)分析 ——哺乳動(dòng)物的穩(wěn)定同位素標(biāo)記。

NanoBRET 也已被證明是了解癌癥相關(guān)癌基因如何隨著癌癥發(fā)展而調(diào)整蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵。 該技術(shù)用于證明與野生型 RAS 蛋白相比，NRAS 突變體與 RAS 效應(yīng)蛋白 RAF1 顯示出更大的相互作用親和力。 9 研究人員證實(shí)，在不分裂開放細(xì)胞的情況下，該突變改變了對(duì)調(diào)節(jié)癌癥很重要的 PPI 網(wǎng)絡(luò)。 Daniels 說，該論文“幫助確定了侵襲性癌癥病例背后的分子機(jī)制，為更好地預(yù)測(cè) RAS 突變的生物學(xué)行為提供了又一步?！?

當(dāng)談到我們這個(gè)時(shí)代的故事時(shí)，COVID-19，SPR 已被證明對(duì)于衡量候選藥物與病毒相互作用的結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)至關(guān)重要。 例如，去年，Regeneron Pharmaceuticals 發(fā)表了針對(duì) SARS-CoV-2 的兩種抗體（casirivimab 和 imdevimab）的結(jié)合動(dòng)力學(xué) 10 ； Belcher 表示，它們是世界衛(wèi)生組織推薦的單克隆療法的一部分。 在該研究中，“Biacore SPR 系統(tǒng)用于確定抗刺突 mAb 與 SARS COV2 刺突蛋白結(jié)合的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和親和力?！?

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定量蛋白質(zhì)組學(xué)

iTRAQ標(biāo)記定量

TMT標(biāo)記定量

DIA非標(biāo)定量

Label free非標(biāo)定量

SILAC標(biāo)記定量

PRM靶向定量

Western Blot

蛋白定性

LC-MS/MS蛋白鑒定

LC-MS/MS修飾位點(diǎn)鑒定

代謝組學(xué)

廣泛靶向代謝組學(xué)

非靶向代謝組學(xué)

靶向代謝組學(xué)

脂質(zhì)組學(xué)