基因組編輯：概述

基因包含編碼生物細胞中蛋白質(zhì)所需的信息。  編輯基因是研究活生物體代謝和生理過程的遺傳基礎(chǔ)的基石。  多年來，科學家為此目的使用了許多技術(shù)，特別是用于研究具有工業(yè)或科學價值的細菌，例如自殺質(zhì)粒。

其他原核生物基因組編輯方法包括 lambda Red 系統(tǒng)和 ClosTron 方法。  傳統(tǒng)的微生物基因組編輯技術(shù)已被證明是緩慢而費力的。

傳統(tǒng)基因組編輯方法的缺點之一是必須將抗性標記盒引入微生物基因組，這不適合更精確的編輯，例如單氨基酸突變。  需要幾個步驟，包括同源重組和切除不必要的 DNA 區(qū)域。  基因組操作會留下干擾下游基因工程的殘余物。  這些缺點促進了對更好方法的需求。

CRISPR-Cas

CRISPR-Cas 是一項極大地改變了基因組編輯方式的技術(shù)。  這項技術(shù)已經(jīng)存在了不到二十年，但已經(jīng)在生物化學、微生物學、藥物開發(fā)和食品工業(yè)等多個領(lǐng)域得到廣泛應用。  該技術(shù)為為特定目的定制微生物開辟了強大的可能性。

CRISPR 是一種比傳統(tǒng) DNA 編輯方法更快、更便宜、更準確的技術(shù)。  它使科學家能夠通過刪除、添加或更改特定的 DNA 部分來編輯基因組的特定部分。

該系統(tǒng)使用兩個關(guān)鍵分子將突變引入 DNA。  這些是一種稱為 Cas9 的酶，它在特定位置切割雙鏈 DNA 以插入新的遺傳鏈，并引導 RNA (gRNA)。gRNA 是預先設計的 RNA 序列，通常包含大約 20 個堿基對長度在較大的 RNA“支架”內(nèi)，它將 Cas9 蛋白引導至目標 DNA 序列進行編輯。  gRNA 具有與目標 DNA 序列互補的堿基。

Cas9 酶切割兩條 DNA 鏈并將 RNA 序列插入遺傳密碼的目標區(qū)域。  細胞識別出DNA受損并用新的DNA序列修復它。  因此，細胞的遺傳密碼被 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)改變，并且可以制造新一代細胞，表達編輯的遺傳密碼并為多種目的制造新蛋白質(zhì)。

Cas基因的功能

Cas（CRISPR相關(guān)）基因常見于細菌和古細菌中。  它們充當識別外源 DNA 的一種方式，本質(zhì)上，CRISPR/Cas 系統(tǒng)是一種原始免疫機制。  迄今為止，已鑒定出多個 Cas 基因，其中 Cas9 是 CRISPR-Cas 技術(shù)中使用最多的基因。

微生物基因組編輯：CRISPR-Cas9 及其他

雖然 CRISPR-Cas9 由于其簡單性和成本優(yōu)勢已被廣泛用于編輯真核細胞，但該系統(tǒng)不太適合細菌基因組編輯。  這是由于該技術(shù)仍然存在的挑戰(zhàn)。  已經(jīng)開發(fā)了多種基于 CRISPR-Cas9 的方法來克服因使用的質(zhì)粒數(shù)量和特定誘導 DNA 修復機制等因素而變化的挑戰(zhàn)。

用于微生物基因組編輯的 CRISPR-Cas9 方法的主要缺點之一是細胞毒性。 這是由于工程微生物中 Cas9 的過度表達（這是 大腸桿菌 ，但也發(fā)生在其他細菌物種中）并導致缺乏菌落。 即使沒有核酸酶活性也會發(fā)生這種情況。 此外，Cas9 錯配可導致微生物基因組內(nèi)脫靶位置的雙鏈斷裂。

已經(jīng)開發(fā)了 CRISPR-Cas 介導的微生物基因組編輯的替代策略，以克服該系統(tǒng)的這些缺點。  其中包括無痕 Cas9 輔助重組、誘導重組酶、在質(zhì)粒中編碼 DNA 修復模板、使用誘導型啟動子、CRISPR 樣 DNA 切口酶的核酸酶、內(nèi)源性 CRISPR 系統(tǒng)，以及使用腺嘌呤脫氨酶等堿基編輯器。

最近探索的另一種替代方法是使用預制的核糖核蛋白 (RNP) 復合物來傳遞 CRISPR-Cas 機器，而不是使用質(zhì)粒。 這種方法用途廣泛。 這種方法的一個優(yōu)點是它不依賴于微生物翻譯和轉(zhuǎn)錄機制，并功效通過核酸酶測定預先 RNP 復合物在使用后降解，避免了 Cas9 的過度表達。

微生物基因組編輯是一種為醫(yī)藥、食品和工業(yè)化學品生產(chǎn)等行業(yè)量身定制多種重要產(chǎn)品的強大方法。  許多傳統(tǒng)的基因組編輯方法費力、昂貴、耗時，并且具有一定程度的不準確性。CRISPR-Cas 已成為編輯真核和原核細胞基因組的核心技術(shù)，但仍存在阻礙其廣泛應用于微生物基因組編輯的挑戰(zhàn)。  這些挑戰(zhàn)目前正在通過研究替代策略來解決，盡管它仍然是一項新技術(shù)，使用這些方法來工程微生物的未來是有希望的。