分子克隆是一種用于創(chuàng)建在細菌或哺乳動物細胞中表達的 DNA 實驗工具的技術， 分子克隆被定義為目標 DNA 序列的分離和擴增。

什么是分子克隆？

分子克隆實驗是一種將外源 DNA 片段插入能夠在宿主細胞中自主復制的載體的技術。 這種宿主細胞通常是一種細菌（ 大腸桿菌 ）。 插入 DNA 的多個拷貝的產(chǎn)生可用于多種目的。

基因調取及合成，分子克隆，cdna克隆服務，輝駿生物自有細胞實驗平臺，克隆實驗包含：從細胞或組織中提取總DNA或總RNA后擴增出目的基因;通過化學合成的方法獲得目的DNA序列。交付產(chǎn)物：含目的基因的質粒和和甘油菌，原始測序文件和拼接文件等，2-4周可得實驗周期短，實驗結果完美。

基因調取/合成cDNA克隆服務信息

分子克隆的要求

要進行克隆實驗，需要幾種材料。  這些包括靶DNA、宿主生物、用于克隆的載體DNA、將外源DNA插入載體的方法、將體外修飾的DNA放入宿主細胞的方法，以及選擇和/或篩選細胞的方法攜帶插入的外源 DNA。

參與分子克隆的酶

有三種類型的酶用于克隆。 這些包括限制性內(nèi)切酶、聚合酶、核酸酶、連接酶、激酶和磷酸酶。切割雙鏈 DNA 核酸 分子的識別位點處或附近稱為限制性位點 。

大多數(shù)插入的片段是由于用稱為限制酶的酶消化現(xiàn)有的 DNA 片段而產(chǎn)生的。結果，產(chǎn)生了約 100 個堿基對長度的短插入片段，這些短插入片段也可以在商業(yè)上合成為單鏈寡核苷酸，然后退火形成雙鏈片段。

聚合酶是催化 DNA 或 RNA 聚合物合成的酶，其序列與原始模板互補。DNA 核酸酶 的斷裂或裂解 磷酸二酯鍵 之間存在脫氧核糖 和 DNA 鏈主鏈中的磷酸殘基外切核酸酶是在 DNA 末端附近切割的核酸酶； 那些在 DNA 鏈 稱為 核酸內(nèi)切酶 。這些不需要用于切割的游離 DNA 末端， 一些酶具有這兩種活性。

連接酶形成磷酸二酯鍵以連接兩段 DNA；  他們利用的是在鎂離子存在下的三磷酸腺苷 (ATP)。  激酶從供體分子轉移磷酸基團，而磷酸酶催化磷酸殘基的去除。

載體 DNA 的選擇

起分子載體作用的 DNA 分子稱為載體。  它們將感興趣的 DNA 攜帶到宿主細胞中并促進其復制。  克隆中使用了三種類型的載體：

1、用于克隆 DNA 小片段的質粒，大約 10 到 15 kb

2、噬菌體 gamma：用于克隆更大的 DNA 片段（~20kb）

3、粘粒：這些質粒含有來自噬菌體 gamma 的 DNA 序列，用于克隆更大的片段（最長 45kb）

在分離目標 DNA 序列后，將該插入片段定位到載體質粒以產(chǎn)生構建體，該質粒是可在細菌細胞如大腸桿菌中繁殖的雙鏈環(huán)狀 DNA 片段。  在實驗室中，載體通常是天然存在的質粒的較小版本，具有以下幾個特征：

1、復制起點

2、報告基因，通常是耐藥基因

3、使 DNA 片段易于插入的獨特限制位點。   這些限制性位點通常聚集在多接頭區(qū)域或多個克隆位點中，這使研究人員能夠為多個插入片段選擇最方便的限制性酶組合。  限制性內(nèi)切酶可以在特定目標處切割 DNA。  限制性內(nèi)切酶的選擇被認為是設計克隆策略時的關鍵步驟。  有幾個在一處切斷雙鏈 DNA，形成平端。   其他形式的限制酶允許在貓的位點有少量堿基突出。  這些被稱為互補的粘性末端，因為它們可以很容易地相互定位，從而提高了連接反應的效率。   這隨后增加了成功克隆事件的機會。  對限制性內(nèi)切酶組合的深思熟慮可以控制插入片段的插入方向，這對許多應用至關重要

分子克隆策略

分子克隆有四個基本步驟：

1、由于多個克隆位點的限制性消化導致載體線性化。

2、將所需或目標 DNA 片段連接到細菌質粒中：連接是將 DNA 插入載體的方法。  連接反應的要求包括兩個或多個 DNA 片段（鈍的或粘性的）、含有 ATP 的緩沖液和 DNA 連接酶

3、將此構建體轉化為載體，如 大腸桿菌 ：這是將體外修飾的 DNA 放入宿主細胞的方法。 在轉化過程中，細菌細胞會吸收裸露的 DNA 分子。 在此之后，細胞變得“有能力”，也就是說，可以接受 DNA 周期以實現(xiàn)這種細胞，然后用冰冷的氯化鈣處理并隨后進行熱休克。 平均 7 到10 8 每微克DNA -3 。 轉化效率定義為用于轉化細菌的每微克 DNA 的菌落形成單位 (CFU) 數(shù)。 在此之后，發(fā)生 DNA 電穿孔進入宿主細胞。 這是電場介導的膜透化的一種形式； 在存在 DNA 的情況下施加高強度電場。

4、篩選陽性連接事件的存在：這是一種選擇攜帶插入 DNA 的細胞的方法。  是指應用促進攜帶載體或載體并插入的細胞生長的條件。  最常見的這些篩選方法包括選擇抗生素抗性、檢查營養(yǎng)需求、使用 β-半乳糖苷酶進行藍白選擇、非常特定類型的篩選，例如使用雜交。  篩選允許細胞生長并測試生成的克隆是否存在插入片段。

在典型的 DNA 克隆程序中，將感興趣的 DNA 片段（最常見的是所需的人類蛋白質）插入構建體中。  這些 DNA 構建體包括一個啟動子元件（啟動或關閉基因所需的 DNA 序列），它連接到報告基因或受啟動子控制的互補 DNA 序列。

報告基因是一種產(chǎn)生分子的基因，該分子在轉染后易于分析，該過程涉及將 DNA 或其他核酸引入真核細胞中，并可用作篩選成功轉染的標志物。

總之，分子克隆涉及載體的制備，“轉化”是任何載體，通常是病毒或質粒，用作載體將 DNA 序列攜帶到宿主細胞中，作為分子克隆程序的一部分。