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中文標題：植物ESCRT組分FREE1穿梭到細胞核以減弱脫落酸信號

發(fā)表期刊：Nature Plants

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：17.352

發(fā)表時間：2019年

合作單位：華南師范大學(xué)

運用技術(shù)：IP-MS/MS磷酸化位點檢測（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復(fù)合體（ESCRT）是真核生物中存在的保守的囊泡運輸調(diào)控機器，由20多個蛋白組成并分成ESCRT-0, -I, -II, -III以及VPS4/SKD1-LIP5等5個蛋白復(fù)合物，它們協(xié)同作用識別泛素化修飾的膜蛋白并將其分選到細胞內(nèi)多泡體（MVB）的內(nèi)小泡中，這樣當(dāng)多泡體與液泡融合后，膜蛋白即被運輸至液泡內(nèi)腔而被降解。已有研究表明，ESCRT蛋白參與了植物激素脫落酸(ABA)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。作者團隊前期已經(jīng)發(fā)掘了植物特有的ESCRT復(fù)合物組分FREE1，并解析了其調(diào)控膜蛋白轉(zhuǎn)運和自噬降解的功能，而有關(guān)ESCRT蛋白通過何組分以及哪種途徑參與植物激素脫r落酸(ABA)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，仍有待進一步研究。

● 研究結(jié)果

1.     通過使用新創(chuàng)建的free1-ctmut植物,發(fā)現(xiàn)FREE1的C-末端盤繞線圈結(jié)構(gòu)域賦予ABA超敏反應(yīng)

在這項研究中，研究者利用CRISPR-Cas9技術(shù)繞過FREE1功能缺失的致死性，得到一個特異影響FREE1蛋白入核的突變體Free1-ctmut。Sanger測序結(jié)果顯示該突變體倒數(shù)第二個外顯子內(nèi)有8bp的缺失(圖1A)，這導(dǎo)致FREE1蛋白序列在581個氨基酸位點上有一個提前終止密碼子，引入了558-581個氨基酸殘基的外源多肽(圖1B)。WB分析檢測到Free1-ctmut植物中較小的內(nèi)源FREE1，表明產(chǎn)生了截短的FREE1蛋白，并缺失了羧基末端的尾巴(圖1C)。Free1-ctmut突變體在正常生長條件下沒有表現(xiàn)出明顯的表型，但與野生型(WT)植株相比，對ABA介導(dǎo)的抑制成苗和ABA誘導(dǎo)的離體葉片衰老表現(xiàn)出更高的敏感性。

FREE1蛋白有三個已知的結(jié)構(gòu)域，包括氨基末端的固有無序區(qū)、FYVE結(jié)構(gòu)域和C-末端卷曲圈區(qū)。為了深入了解FREE1蛋白不同結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)Free1-ctmut植株脫落酸(ABA)敏感性中的作用，本研究將4個不同版本的綠色熒光蛋白分別與FREE1、Free1-ctmut、FREE1(?FYVE)和FREE1(?CC)融合到Free1-ctmut中，并對其進行了表型分析。如圖1D-F所示，全長FREE1完全補充了Free1-ctmut的ABA敏感表型，而C-末端截短的Free1-ctmut和FREE1(?CC)未能補充Free1-ctmut的表型，突出了FREE1 C末端在賦予Free1-ctmut植物的ABA超敏感表型中的功能重要性。先前的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)REE1的N端部分負責(zé)其與ABA受體的相互作用，而這個新建立的Free1-ctmut植物中，缺失部分位于C端卷曲區(qū)域(圖1)，理論上不影響FREE1與ABA受體的相互作用。因此，F(xiàn)ree1-ctmut的ABA超敏反應(yīng)不太可能是由MVB介導(dǎo)的空泡分選缺陷和ABA受體的降解引起的。研究者通過雜交實驗進一步驗證猜想，并得出結(jié)論：Free1-ctmut作為ESCRT組分正常發(fā)揮作用，F(xiàn)REE1通過C末端負性調(diào)節(jié)ABA反應(yīng)，其機制不同于先前報道的FREE1調(diào)節(jié)ABA受體內(nèi)體分選的功能。

圖1

2. ABA促進FREE1核輸入，核定位的FREE1補充FREE1-ctmut對ABA的超敏反應(yīng)

接下來，研究者使用先前建立的GFP-FREE1/FREE1互補系觀察了FREE1亞細胞定位模式對ABA的響應(yīng)。有趣的是，ABA處理導(dǎo)致在共聚焦顯微鏡下觀察到的細胞核中GFP-FREE1的水平顯著增加，并在免疫印跡分析中檢測到。(圖2A，B)。此外，WT植株細胞核中內(nèi)源FREE1水平的增加對ABA的響應(yīng)進一步支持了ABA促進FREE1核進入的結(jié)論(圖2C)。此外，在GFP-FREE1-CTmut/Free1-ctmut系(圖2D)中，細胞核中GFP-FREE1-CTmut的水平?jīng)]有明顯增加。此外，F(xiàn)REE1抗體的WB分析進一步證實，內(nèi)源FREE1-CTmut蛋白未能對ABA做出反應(yīng)而移位到細胞核(圖2E)。這些結(jié)果表明，F(xiàn)REE1可能通過其在細胞核內(nèi)的作用發(fā)揮其對ABA信號的抑制作用，而FREE1的C末端對于其穿梭到細胞核和植物對ABA的響應(yīng)是必不可少的。為了提高FREE1在細胞核中的表達水平，研究者建立了GFP-FREE1-NLS/FREE1-ctmut和GFP-FREE1-NES(Mut)/FREE1-ctmut轉(zhuǎn)基因株系。GFP-FREE1-NLS顯示顯性的細胞核定位，而GFP-FREE1-NES(Mut)在沒有ABA處理的情況下核定位明顯增加(圖2F)。進一步的表型分析表明，GFP-FREE1-NLS和GFP-FREE1-NES(Mut)都能夠補充FREE1-ctmut對ABA的超敏表型(圖2G，H)。綜上所述，ABA處理促進了FREE1的核積累，但不促進FREE1-CTmut的核積累，次外，F(xiàn)REE1的核積累能夠補充FREE1-ctmut對ABA的敏感表型。

圖2

3. ABA促進FREE1磷酸化，磷酸化的FREE1主要定位于細胞核

大量研究表明，磷酸化修飾可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)核質(zhì)穿梭。為了驗證FREE1在用ABA處理時是否會發(fā)生磷酸化修飾，研究者檢測了有或沒有ABA處理的FREE1的磷酸化水平，結(jié)果顯示ABA處理顯著增加了FREE1的磷酸化水平（圖3A）。在GFP-FREE1CTmut/FREE1-CTmut系中檢測FREE1-CTmut的磷酸化水平，結(jié)果表明，F(xiàn)REE1-CTmut磷酸化水平的增加遠小于FREE1（圖3A），這表明ABA誘導(dǎo)的FREE1磷酸化需要C端。接下來，研究者在核和胞質(zhì)組分中檢測有無ABA處理的FREE1磷酸化水平，結(jié)果表明，磷酸化的FREE1主要位于細胞核中（圖3B），表明FREE1可能需要進行磷酸化修飾才能在細胞核中積累。后續(xù)的時程和劑量反應(yīng)實驗也進一步表明，ABA能夠誘導(dǎo)FREE1磷酸化，這需要FREE1的C末端；磷酸化的FREE1主要位于細胞核中。

圖3

4. 依賴于SnRK2.2/2.3的FREE1磷酸化是ABA誘導(dǎo)的FREE1核輸入所必需的

多研究表明，SnRK2分支蛋白激酶，包括SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6，是介導(dǎo)植物對ABA反應(yīng)的關(guān)鍵正調(diào)控因子，ABA強烈激活A(yù)BA以進一步磷酸化下游因子。為了測試SnRK2激酶是否磷酸化FREE1對ABA的響應(yīng)，研究者通過雙分子熒光互補(BIFC)等分析證實了FREE1與SnRK2.2/2.3在擬南芥葉片原生質(zhì)體的細胞核和胞漿中的相互作用(圖3C）。Co-IP結(jié)果表明，ABA處理增強了FREE1與SnRK2.2和SnRK2.3之間的聯(lián)系(圖3D)。接下來，研究者利用幾個含有結(jié)構(gòu)域截斷的FREE1突變體，用于與SnRK2的相互作用分析。結(jié)果表明，F(xiàn)REE1的C-末端卷曲區(qū)負責(zé)與SnRK2.2和SnRK2.3的相互作用。

接下來，研究者進行了體外磷酸化實驗，以測試SnRK2激酶是否直接磷酸化FREE1。將純化的His-SUMO-FREE1分別與ABA處理的轉(zhuǎn)基因植物GFP-SnRK2蛋白和大腸桿菌His-MBP-SnRK2蛋白孵育。在這兩種情況下，His-SUMO-FREE1的磷酸化都很容易檢測到(圖3E)。此外，體內(nèi)外實驗結(jié)果表明，SnRK2.2和SnRK2.3是ABA誘導(dǎo)FREE1磷酸化的預(yù)期激酶蛋白。為了進一步揭示ABA誘導(dǎo)和SnRK2S依賴的FREE1磷酸化是否與ABA誘導(dǎo)的FREE1核導(dǎo)入有關(guān)，研究者將GFP-FREE1導(dǎo)入現(xiàn)有SnRK2.2/2.3/2.6三重突變體的葉片原生質(zhì)體中，在ABA處理后的SnRK2.2/2.3/2.6原生質(zhì)體中沒有觀察到明顯的FREE1核導(dǎo)入增加(圖3F)。這一觀察結(jié)果得到證據(jù)的支持，即在ABA處理后，SnRK2.2/2.3/2.6三重突變體細胞核中內(nèi)源性FREE1的水平?jīng)]有明顯增加(圖3G)。綜上所述，這些結(jié)果表明，依賴于SnRK2.2和SnRK2.3的FREE1磷酸化對于ABA誘導(dǎo)的FREE1核進口是必要的。

5. ABA誘導(dǎo)的FREE1核進口需要絲氨酸殘基S530/S533的磷酸化

為了確定相應(yīng)的FREE1磷酸化殘基對ABA的響應(yīng)，研究者對免疫沉淀的GFP-FREE1和GFP-Free1-ctmut蛋白進行了質(zhì)譜分析。結(jié)果顯示，在GFP-Free1-ctmut蛋白中檢測到的兩個磷酸化位點S530和S533位于FREE1 C-末端卷曲圈區(qū)，而GFP-FREE1-CTmut蛋白中檢測不到。Free1-ctmut蛋白的缺失可能破壞了盤繞區(qū)域的結(jié)構(gòu)，從而降低了S530和S533的磷酸化。因此，我們將目前的研究重點放在S530和S533在誘導(dǎo)ABA反應(yīng)中的功能特性上。

為了進一步驗證S530和S533的磷酸化是否參與了ABA誘導(dǎo)的FREE1核輸入，我們將YFP-FREE1(S530A/S533A)和YFP-FREE1(S530D/S533D)這兩個絲氨酸位點突變?yōu)榉橇姿峄谋彼峄蛄姿峄奶於彼釟埢?，引入到FREE1突變株中，進行FREE1定位觀察和植物表型分析。對ABA處理和未處理的植株不同蛋白質(zhì)組分的共聚焦觀察和免疫印跡分析均未發(fā)現(xiàn)YFP-FREE1(S530A/S533A)在細胞核內(nèi)明顯積聚(圖4B，C)。相反，YFP-FREE1(S530D/S533D)在沒有ABA處理的補充植株中表現(xiàn)出明顯的核積累(圖4D，E)。此外，與免疫沉淀-質(zhì)譜結(jié)果一致，ABA處理的轉(zhuǎn)基因植株和體外磷酸化實驗中純化的His-SUMO-FREE1(S530A/S533A)的YFPFREE1(S530A/S533A)的磷酸化水平都明顯降低(圖3E、4F)。YFP-FREE1(S530A/S533A)/Free1-ctmut表現(xiàn)出與Free1-ctmut相似的ABA過敏性，而YFP-FREE1(S530D/S533D)/Free1-ctmut在成苗和ABA誘導(dǎo)的葉片衰老方面與WT相似(圖4G，H)，進一步支持S530/S533的磷酸化是必需的。

圖4

6. FREE1通過抑制ABF4和ABI5的DNA結(jié)合能力來抑制ABF4和ABI5的轉(zhuǎn)錄活性

為了研究FREE1在細胞核中的功能對ABA的響應(yīng)，研究者以FREE1(231-601)的C末端部分為誘餌，在擬南芥互補DNA文庫中進行了酵母雙雜交篩選，在陽性克隆鑒定了編碼轉(zhuǎn)錄激活因子ABF4和ABI5的克隆，用于進一步的蛋白質(zhì)相互作用分析。酵母雙雜交結(jié)果顯示，ABF4和ABI5都與FREE1(231-601)相互作用(圖5A)，BIFC分析進一步證實了這種相互作用(圖5B)。在酵母雙雜交試驗中進一步的精細定位表明，F(xiàn)ree1-ctmut(231-581)失去了與ABF4和ABI5的相互作用，而缺失了N末端的FREE1(421-601)仍然可以與這些轉(zhuǎn)錄因子相互作用。這些結(jié)果表明，F(xiàn)REE1的C端螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)ｉT負責(zé)與ABF4和ABI5的DNA結(jié)合域的相互作用(圖5A)。免疫共沉淀試驗表明，在沒有ABA的情況下，F(xiàn)REE1與ABF4或ABI5之間的相互作用很弱，但在ABA處理后得到加強(圖5C，D)。這些結(jié)果表明，F(xiàn)REE1C-末端殘基的磷酸化在調(diào)節(jié)ABA反應(yīng)中起著重要作用。

為了確定FREE1是否影響ABF4和ABI5在植物細胞中的轉(zhuǎn)錄激活活性，研究者在擬南芥原生質(zhì)體中進行了雙熒光素酶的報告實驗。結(jié)果表明，在ABF4或ABI5單獨存在的情況下，ABA顯著誘導(dǎo)PAO1或EM6的表達，當(dāng)與GFP-FREE1共表達時，這種誘導(dǎo)被顯著抑制，但與GFP對照(圖5E，F(xiàn))不同，這表明FREE1直接抑制ABF4和ABI5對ABA的轉(zhuǎn)錄激活活性。接下來，為了檢測FREE1是否通過競爭性結(jié)合ABF4和ABI5轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域來抑制這兩種轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性，研究者通過電泳遷移率改變分析(EMSA)研究了FREE1對這兩種轉(zhuǎn)錄因子與下游基因順式調(diào)控序列結(jié)合活性的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)REE1，而不是GFP對照，以劑量依賴的方式抑制ABF4和ABI5的DNA結(jié)合能力(圖5G，H)，說明了FREE1對ABF4和ABI5轉(zhuǎn)錄激活活性的直接抑制作用。利用ChIP-qPCR方法進一步檢測Free1-ctmut突變是否會導(dǎo)致GFP-ABF4和GFP-ABI5對其靶基因啟動子序列的富集作用增強，并以GFP為陰性對照。結(jié)果表明，F(xiàn)REE1確實減弱了ABF4和ABI5對下游靶基因啟動子區(qū)域的DNA結(jié)合能力(圖5I，J)。

圖5

7. ABF4或ABI5的缺失挽救了在Free1-ctmut突變體中產(chǎn)生的ABA超敏表型

Free1-ctmut突變體對ABA的超敏表型很可能主要是由于ABF4和ABI5在細胞核內(nèi)過度激活而沒有FREE1抑制所致。為了證實這種可能性，研究者測試了ABF4或ABI5的缺失是否會通過使Free1-ctmut與ABF4或ABI5突變體雜交來挽救在Free1-ctmut突變體中觀察到的ABA超敏表型。與預(yù)期一致，F(xiàn)ree1-ctmut的ABF4或ABI5突變在成苗和ABA誘導(dǎo)的葉片衰老方面都表現(xiàn)出WT ABA反應(yīng)(圖6A，B)，即Free1-ctmut的ABA敏感表型可能是由ABF4和ABI5轉(zhuǎn)錄活性的過度激活引起的。此外，接下來，研究者檢測了ABA反應(yīng)基因NYE1、NYC1、PAO1、RD29A、RD29B、NYE2和SAG29在WT、Free1-ctmut突變體ABF4、ABI5、Free1-ctmut/ABF4和Free1-ctmut/ABI5中的相對表達水平。結(jié)果顯示，所有檢測到的基因在未經(jīng)ABA處理的Free1-ctmut突變體中的表達均升高，而在ABA處理下，表達誘導(dǎo)的升高更為顯著。然而，ABF4或ABI5突變消除了Free1-ctmut中ABA反應(yīng)基因的這種表達誘導(dǎo)(圖6C，D)?？傊@些結(jié)果表明，在Free1-ctmut中ABA反應(yīng)基因的表達上調(diào)是由于ABF4和ABI5轉(zhuǎn)錄活性的過度激活所致。

圖6

● 結(jié)論

研究在轉(zhuǎn)錄水平上證明了細胞膜轉(zhuǎn)運和ABA信號之間的串?dāng)_，并強調(diào)了植物ESCRT亞基FREE1的兼職特性，它除了在細胞質(zhì)中的膜轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用外，還在細胞核中進化了獨特的非內(nèi)體功能。

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