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中文標題：Lnc-GD2H促進成肌細胞增殖和分化的機制研究

發(fā)表期刊：Frontiers in Cell and Developmental Biology

中科院分區(qū)：2區(qū)

影響因子：6.684

發(fā)表時間：2021年8月

合作單位：廣東省第二中醫(yī)院

運用技術：ChIP qPCR、RIP-qPCR、RNA  pull down MS、DNA pull down、雙熒光素酶實驗

（由輝駿生物提供技術支持，點擊查看服務詳情）

● 研究背景

成肌細胞決定蛋白（MyoD）、肌源性因子5（Myf5）、肌生成素（Myog）和肌特異性調節(jié)因子4（MRF4）等肌源性調節(jié)因子（MRFs）主要調節(jié)成肌細胞的增殖、分化和融合。除此之外，非肌肉特異性轉錄因子也參與肌肉再生，例如NACA可以與Myog啟動子結合，抑制Myog轉錄和成肌細胞分化；c-Myc可以通過miRNA和長非編碼RNA（lncRNA）的轉錄來調節(jié)成肌細胞的增殖和分化。研究團隊之前已經發(fā)現一種lncRNA Gm13398在小鼠C2C12成肌細胞增殖和分化過程中高表達，并在成肌細胞分化過程中與Myog共表達。本研究將Gm13398命名為lnc-GD2H，探討了其在成肌細胞的增殖和分化中的作用。

● 研究結果

1. Lnc-GD2H在成肌細胞增殖和分化中的表達模式及RNA-FISH定位

qPCR檢測了lnc-GD2H、c-Myc和Myog在C2C12成肌細胞增殖和分化過程中的表達模式。圖1A為成肌細胞形態(tài)，lnc-GD2H的水平隨增殖和分化過程而逐漸增加（圖1B）。c-Myc在增殖過程中上調，但在分化后下調（圖1C）。Myog在分化過程中顯著上調（圖1D）。這些結果表明lnc-GD2H可能是一種參與細胞增殖和分化的肌源性因子。RNA FISH顯示，在成肌細胞增殖和分化過程中，lnc-GD2H分布在細胞質和細胞核（圖1E）。

  圖1

2. Lnc-GD2H促進成肌細胞增殖，并促進該過程中的c-Myc表達                                                              

接著，研究人員構建了lnc-GD2H過表達的C2C12成肌細胞穩(wěn)轉株（圖2A），并通過不同實驗確定了lnc-GD2H在成肌細胞增殖中的潛在功能。qPCR和WB結果表明lnc-GD2H過表達導致c-Myc、CDK2、CDK4和CDK6這些增殖標志物的mRNA和蛋白水平升高（圖2B、C）。lnc-GD2H過表達細胞中的EdU陽性細胞百分比顯著高于對照（圖2D，E）。CCK-8和細胞劃痕實驗證實lnc-GD2H過表達使成肌細胞有更高的存活率，促進了其增殖和遷移潛力。相反，lnc-GD2H干擾（圖3A）抑制了C2C12細胞的增殖，c-Myc、CDK2、CDK4和CDK6 mRNA（圖3B）和蛋白質（圖3C）水平降低，EdU陽性細胞百分比降低（圖3D，E），細胞存活率降低（圖3F）。細胞劃痕12和24小時，lnc-GD2H干擾細胞中的傷口大小顯著大于對照細胞（圖3G，h）。這些結果表明，lnc-GD2H對C2C12成肌細胞增殖有至關重要，并可能促進c-Myc的表達。

圖2

圖3

3. c-Myc在成肌細胞增殖過程中調節(jié)Lnc-GD2H的轉錄

那么，轉錄因子c-Myc是否也會影響Lnc-GD2H水平呢？研究人員同時構建了c-Myc過表達和干擾的C2C12穩(wěn)轉細胞株（圖4A-B，D-E），c-Myc過表達或干擾分別促進和抑制了lnc-GD2H的水平（圖4C-F）。雙熒光素酶實驗證實c-Myc增強了lnc-GD2H啟動子的活性（圖4G，H）；DNA pull down WB實驗再次確定了lnc-GD2H啟動子和c-Myc蛋白的結合（圖4I）。之后，截短啟動子的雙熒光素酶實驗發(fā)現結合位點存在于lnc-GD2H啟動子中?1400至?2000的位置（圖4J），研究者預測了c-Myc轉錄因子的三個結合位點（圖4K）并同時突變它們，發(fā)現c-Myc不再促進lnc-GD2H啟動子的活性（圖4L），表明c-Myc可以與lnc-GD2H啟動子上的這些位點結合。

圖4

4. Lnc-GD2H在成肌細胞分化過程中促進細胞分化

C2C12分化過程中的lnc-GD2H表達增加，提示lnc-GD2H也可能在成肌細胞分化過程中發(fā)揮作用。進一步的實驗結果顯示：lnc-GD2H過表達后，MyHC蛋白（一種終末分化標志物）的免疫熒光增強（圖5A），MyHC蛋白WB條帶也顯著高于對照（圖5C），成肌細胞的融合指數更高（圖5B），肌源性標志物基因Myog、Mef2a和Mef2c的表達增加（圖5D，E），這些結果表明了C2C12分化的顯著加速。相反，lnc-GD2H干擾抑制了C2C12成肌細胞分化，表現為：MyHC免疫染色和蛋白水平降低（圖5F，H），融合指數降低（圖5G），Myog、Mef2a和Mef2c的表達減弱（圖5I，J）。

圖5

5. Lnc-GD2H與NACA蛋白相互作用

為了研究lnc-GD2H的相互作用蛋白，他們采用生物素RNA pull down MS實驗，調取并鑒定了lnc-GD2H的互作蛋白（圖6A），驚喜的發(fā)現了參與細胞發(fā)育過程的關鍵轉錄因子NACA（圖6B，C）。在線數據庫RPISeq的分析結果也表明lnc-GD2H很可能與NACA結合（圖6D）。為了驗證它們之間的相互作用，研究人員用C2C12細胞提取物進行了RIP qPCR檢測（圖6E，F），結果顯示，與IgG對照相比，NACA抗體的pull down富集了更多的lnc-GD2H（圖6F），證實了lnc-GD2H與NACA蛋白的相互作用。

圖6

6. Lnc-GD2H降低了Myog啟動子中的NACA蛋白富集

基于以前的報道，研究者預測發(fā)現Myog基因的啟動子區(qū)域存在NACA蛋白的兩個潛在結合位點，因此他們做了野生和突變Myog啟動子的雙熒光素酶實驗，結果顯示NACA顯著降低了野生Myog啟動子的活性（圖7A），但不能降低突變Myog啟動子的活性（圖7B），表明這兩個預測位點可能是NACA的結合位點。此外，NACA干擾增強了Myog的mRNA（圖7C）和蛋白質水平（圖7D）。lnc-GD2H的過表達逆轉了NACA過表達引起的Myog啟動子雙熒光素酶活性下降（圖7E）。此外，ChIP-PCR顯示，lnc-GD2H過表達顯著干擾了NACA在Myog啟動子區(qū)的富集（圖7F）。這些發(fā)現表明lnc-GD2H可以與轉錄因子NACA結合來減輕NACA對Myog的抑制作用，改善Myog的轉錄以促進成肌細胞分化。

圖7

7. Lnc-GD2H促進肌肉的損傷修復和再生

以上研究結果強調了lnc-GD2H在成肌細胞增殖和分化中的作用，提示lnc-GD2H可能對肌肉再生有影響。接下來，研究者給小鼠注射CTX來誘導損傷，并在注射CTX的前一天（-1）、注射后的第1天和第4天分別注射三次silnc-GD2H和siNC（圖8A），來觀察lnc-GD2H對體內肌肉再生的影響。H&E染色顯示，在CTX損傷后的第3天和第6天， silnc-GD2H注射肌肉的再生肌纖維明顯小于siNC注射肌肉（圖8B），并且在損傷第6天的平均CSA也較?。▓D8C）。在損傷第3天，注射silnc-GD2H導致lnc-GD2H顯著下調（圖8D），c-Myc和Myog的mRNA（圖8D）和蛋白質（圖8E）水平也顯著降低。損傷第6天也有類似的結果（圖8F、G），這些結果表明lnc-GD2H可能促進肌肉損傷的修復和肌肉再生。

圖8

● 研究結論

本研究發(fā)現lnc-GD2H對C2C12成肌細胞的增殖和分化有顯著貢獻。lnc-GD2H通過與c-Myc形成反饋環(huán)來促進增殖，并通過與NACA相互作用來上調Myog從而增強分化。這些結果為lncRNA參與肌肉再生的調控提供了新的思路和治療靶點。

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