RIP、RIP-seq或RNA免疫沉淀、RNA免疫沉淀測序是一種高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)，用于研究RNA和RNA結(jié)合蛋白之間的相互作用。它允許識(shí)別細(xì)胞或組織內(nèi)的特定RNA結(jié)合蛋白。

為什么研究RNA修飾是有益的？

研究RNA修飾對(duì)于解開RNA生物學(xué)的復(fù)雜性，理解基因表達(dá)調(diào)控，破譯疾病機(jī)制以及探索診斷和治療應(yīng)用至關(guān)重要。它提供了對(duì)RNA分子及其在細(xì)胞過程和疾病中的作用的更深層次的理解。

RNA修飾的失調(diào)已經(jīng)涉及各種疾病，包括癌癥、神經(jīng)病癥和代謝病癥。了解RNA修飾為開發(fā)靶向治療方法提供了機(jī)會(huì)。通過操縱負(fù)責(zé)添加或刪除特定RNA修飾的酶，可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，改變RNA結(jié)構(gòu)或糾正疾病狀態(tài)中的異常RNA修飾。此外，調(diào)節(jié)RNA修飾可以為治療干預(yù)提供新的途徑。了解RNA修飾及其功能后果的前景可以指導(dǎo)RNA靶向治療和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方法的發(fā)展。

RIP/RIP-seq提供了對(duì)RNA結(jié)合靶點(diǎn)的關(guān)鍵見解，以及RNA結(jié)合蛋白在RNA生物學(xué)，基因表達(dá)調(diào)控和疾病中的機(jī)制作用。RIP-seq使研究人員能夠深入了解RNA靶點(diǎn)和RBP在各種細(xì)胞過程中的調(diào)控作用，如RNA剪接、穩(wěn)定性、運(yùn)輸和翻譯。通過比較來自不同實(shí)驗(yàn)條件或細(xì)胞類型的RIP-seq數(shù)據(jù)，研究人員可以研究RBP結(jié)合模式的變化，并揭示基因表達(dá)的潛在調(diào)控機(jī)制。它有助于我們理解RNA-蛋白質(zhì)相互作用，并且在揭示RBP在各種生物過程和疾病中的作用方面特別有價(jià)值。

RIP/RIP-seq是如何工作的？

RIP是一種涉及RBPs沿著其相關(guān)RNA分子的免疫沉淀的方法。該技術(shù)背后的原理是使用化學(xué)交聯(lián)劑（通常為甲醛）將RBP交聯(lián)到RNA，所述化學(xué)交聯(lián)劑在特定時(shí)刻“凍結(jié)”RNA和RBP之間的相互作用。然后使用對(duì)目標(biāo)RBP具有特異性的抗體對(duì)細(xì)胞或組織裂解物進(jìn)行免疫沉淀。然后純化免疫沉淀的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，并逆轉(zhuǎn)交聯(lián)以釋放RNA分子。最后，分析富集的RNA以鑒定結(jié)合的轉(zhuǎn)錄物。

RIP-seq將RIP技術(shù)與高通量測序技術(shù)相結(jié)合，允許對(duì)與RBP結(jié)合的RNA分子進(jìn)行全基因組鑒定和表征。在免疫沉淀步驟之后，將純化的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA片段文庫，然后使用下一代測序平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行測序。由此產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)提供了有關(guān)RBP結(jié)合的RNA序列的信息，使研究人員能夠識(shí)別目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本。

以下是RIP/RIP-seq工作流的概述：

1. 交聯(lián)：RIP-seq的第一步涉及將RBP與細(xì)胞內(nèi)的RNA分子交聯(lián)。這通常通過用化學(xué)交聯(lián)劑如甲醛處理細(xì)胞來完成。交聯(lián)有助于保持RBP-RNA相互作用，并防止它們在隨后的加工步驟中解離。

2. 細(xì)胞裂解和免疫沉淀：然后裂解交聯(lián)的細(xì)胞以釋放細(xì)胞內(nèi)容物。將對(duì)靶RBP具有特異性的抗體添加到裂解物中，并且這些抗體選擇性地結(jié)合感興趣的RBP。然后使用蛋白A/G珠等技術(shù)免疫沉淀RBP-RNA復(fù)合物，其結(jié)合抗體-RBP復(fù)合物。

3. RNA片段化：用RNase處理免疫沉淀的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物以消化未結(jié)合的RNA分子，留下RBP結(jié)合的RNA。然后從復(fù)合物中除去RBP，只留下與感興趣的蛋白質(zhì)相關(guān)的RNA分子。

4. RNA純化：從剩余的蛋白質(zhì)片段、污染物和交聯(lián)中純化RNA。這一步驟涉及各種酶處理和柱純化，以獲得高質(zhì)量的RNA。

5. 文庫制備和測序：通過添加銜接子并擴(kuò)增RNA片段將純化的RNA轉(zhuǎn)化為測序文庫。然后使用下一代測序（NGS）技術(shù)等平臺(tái)對(duì)文庫進(jìn)行高通量測序。

6. 數(shù)據(jù)分析：將所得測序讀數(shù)與參考基因組或轉(zhuǎn)錄組比對(duì)，以鑒定由RBP結(jié)合的RNA分子的區(qū)域。數(shù)據(jù)分析包括識(shí)別代表RBP結(jié)合位點(diǎn)的富集區(qū)域（峰），以及下游分析，以了解RBP-RNA相互作用的功能意義。

輝駿生物RIP（RNA免疫共沉淀）服務(wù)內(nèi)容

1. RIP-qPCR，用于檢測某樣本中的誘餌蛋白和待測RNA是否結(jié)合；

2. RIP-seq，用于篩選某樣本中的誘餌蛋白可以結(jié)合哪些RNA。

RNA免疫沉淀（RIP）* 實(shí)驗(yàn)流程

圖一：內(nèi)源蛋白的RNA免疫共沉淀流程圖

圖二：標(biāo)簽融合蛋白的RNA免疫共沉淀流程圖

RIP實(shí)驗(yàn)客戶文章

1. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA.Nature Methods,15(3): 213–220. 2018，IF=28.467. 【研究內(nèi)容】：輝駿生物為作者單位之一，和作者共同開發(fā)了一種捕獲鑒定新生RNA結(jié)合蛋白的全新方法（RICK）。該方法用EU標(biāo)記新生RNA，通過點(diǎn)擊反應(yīng)-生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)結(jié)合質(zhì)譜分析，分離鑒定RNA互作蛋白。其中，METTL1和CDK1是兩個(gè)RICK獨(dú)有的RNA結(jié)合蛋白。 RIP-qPCR、RIP-Seq、CLIP-Seq等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了它們與非PolyA RNA的結(jié)合，這種結(jié)合在細(xì)胞分化與增殖中發(fā)揮了重要作用。 使用相關(guān)技術(shù)：RIP-qPCR、RNA免疫共沉淀RIP-Seq、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù)

2. Bao. X.C. et al: The p53-induced lincRNA-p21 derails somatic cell reprogramming by sustaining H3K9me3 and CpG methylation at pluripotency gene promoters. Cell Research.2015, IF=13.9. 【研究內(nèi)容】：客戶利用RNA pull down、CoIP等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)lincRNA-p21與HNRNPK結(jié)合，并和甲基化酶SETDB1、DNMT1形成復(fù)合物，作者通過RIP-qPCR進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞中存在該復(fù)合物。該復(fù)合物甲基化了多能性基因的啟動(dòng)子序列及相應(yīng)組蛋白，并改變了它們的表達(dá)量，從而進(jìn)一步影響體細(xì)胞重編程過程。 使用相關(guān)技術(shù)：RIP seq、RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀rip qpcr、質(zhì)譜鑒定

3. Zhang C Y . et al: CircVPRBP inhibits nodal metastasis of cervical cancer by impeding RACK1 O-GlcNAcylation and stability. Oncogene. 2023, IF=8.756. 【研究內(nèi)容】：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸癌（CCa）患者最惡性的臨床特征之一。本研究利用RNA pull down、RIP和Co-IP等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：circVPRBP與OGT酶競爭結(jié)合RACK1蛋白，阻礙RACK1-S122位點(diǎn)的O-GlcNAc修飾來使其降解，從而抑制宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管生成。 使用相關(guān)技術(shù)：RIP-qPCR、RNA pull down MS、免疫共沉淀Co-IP、質(zhì)譜鑒定