蛋白質(zhì)間相互作用是其發(fā)揮功能的主要模式，蛋白質(zhì)通過結(jié)合不同的伙伴來行駛不同功能，形成復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)。免疫共沉淀（Co-IP）、pull down、熒光共定位等都是最常見的蛋白互作研究方法。

免疫共沉淀Co-IP：采用誘餌蛋白抗體或標(biāo)簽抗體（當(dāng)誘餌蛋白融合特定標(biāo)簽時）調(diào)取體內(nèi)結(jié)合的蛋白復(fù)合體，反應(yīng)的是最真實的生理結(jié)合。合適的IP抗體是決定實驗成功的關(guān)鍵。

pull down：在體外條件下研究蛋白間相互作用的方法，還可以確定蛋白間是否存在直接的相互作用。將目標(biāo)蛋白與標(biāo)簽（GST或His等）在大腸桿菌中融合表達，借助標(biāo)簽的親和介質(zhì)純化目標(biāo)蛋白及其互作蛋白復(fù)合物，不受抗體限制。

熒光共定位：依靠熒光確定蛋白質(zhì)具有相同定位，用于輔助證明而非直接證明細胞內(nèi)蛋白間的相互作用。

這些方法相互補充，通過多種方法共同驗證蛋白質(zhì)間的相互作用，能更大程度的避免假陽性結(jié)果。

輝駿生物的合作伙伴——中山大學(xué)腫瘤中心華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室在Cancer Research（1區(qū)，IF=12.5）上發(fā)表的論文“A GYS2/p53 Negative Feedback Loop Restricts Tumor Growth in HBV-Related Hepatocellular Carcinoma”，就同時采用了Co-IP和GST pull down方法，研究了糖原合成酶2(GYS2)在乙肝病毒相關(guān)性肝癌中的機制。下面我們來一起看一下這篇論文的研究思路。

研究路線：

1.     表達分析和細胞實驗發(fā)現(xiàn)：GYS2在肝細胞癌(HCC)中顯著下調(diào)，與糖原含量降低和患者不良預(yù)后有關(guān)；缺失GYS2極大地促進了肝癌細胞的生長。

2.     RNA-seq發(fā)現(xiàn)：GYS2過表達導(dǎo)致p53蛋白上調(diào)，進而影響了p53的很多靶基因。

3.     Co-IP、GST pull-down和功能恢復(fù)實驗證實：GYS2與p53直接相互作用，并通過p53抑制肝癌生長。

4.     泛素化IP-WB實驗發(fā)現(xiàn)：過表達GYS2減弱了p53蛋白的泛素化降解。

5.     Co-IP、GST pull-down實驗表明：GYS2與E3泛素連接酶MDM2競爭性結(jié)合來穩(wěn)定p53。

6.     雙熒光素酶、ChIP和乙酰化檢測發(fā)現(xiàn)：p53蛋白又能與GYS2啟動子結(jié)合，通過p300介導(dǎo)的乙酰化抑制GYS2轉(zhuǎn)錄活性，負反饋調(diào)節(jié)GYS2。

7.     表達檢測發(fā)現(xiàn)：在HBx(HBV編碼的關(guān)鍵致癌蛋白)陽性的肝癌病例中，GYS2低表達；與HBx互作的HDAC1(組蛋白去乙?；?被敲低時，GYS2表達上調(diào)，說明HBx和HDAC1都會抑制GYS2的表達。

8.     Co-IP、雙熒光素酶和ChIP實驗發(fā)現(xiàn)：HBx、HDAC和細胞核內(nèi)乙?；膒53形成復(fù)合體，共同調(diào)控GYS2啟動子活性。

研究總結(jié)：

作者首先發(fā)現(xiàn)了GYS2在HCC中明顯下調(diào)，并與糖原含量降低和不良患者預(yù)后相關(guān)。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明GYS2低表達與p53通路有關(guān)，因此對它們展開了研究。體內(nèi)體外實驗證實了兩者與HCC的關(guān)系。

為了展開機制研究，作者采用了多種蛋白-蛋白、蛋白-DNA相互作用的方法，描述了GYS2與E3泛素連接酶MDM2競爭結(jié)合p53蛋白，減弱其泛素化降解以維持其水平，此外，p53與HBx、HDAC1蛋白形成復(fù)合體，共同調(diào)控GYS2啟動子活性，進而負反饋調(diào)節(jié)GYS2水平。由此可見，互作實驗技術(shù)在分子機制研究方面具有重要的應(yīng)用價值。

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