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肽和蛋白質(zhì)從頭測(cè)序的質(zhì)譜方法

從頭測(cè)序是一種分析和鑒定肽序列和一些翻譯后修飾蛋白的方法。 與其他一些分析方法依賴于已知的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)或已知的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)不同，denovo 測(cè)序使用串聯(lián)質(zhì)譜法根據(jù)肽段的斷裂特征進(jìn)行直接分析。 因此，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中未包含的肽序列、新物種的蛋白質(zhì)序列和基因組尚未測(cè)序的蛋白質(zhì)序列都可以進(jìn)行分析。 該方法開發(fā)的軟件包括 PepNovo、PEAKS 和 pNovo。

質(zhì)譜法肽和蛋白質(zhì)從頭測(cè)序的基本原理

在質(zhì)譜分析中，待分析物質(zhì)的粒子在通過電磁場(chǎng)之前首先被電離。 由于不同質(zhì)荷比的離子在電磁場(chǎng)中受到不同的作用力，它們的運(yùn)動(dòng)軌跡和飛行時(shí)間，能夠分離和檢測(cè)離子的特性是不同的。 在使用串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行肽段鑒定的過程中，肽段從頭測(cè)序可以直接從二級(jí)圖譜中推斷出最可能的肽段序列。 找到特定的斷裂模式后，可以根據(jù)質(zhì)譜峰與氨基酸翻譯后修飾的質(zhì)量差異計(jì)算出相應(yīng)的氨基酸信息。

通過質(zhì)譜法進(jìn)行肽和蛋白質(zhì)從頭測(cè)序的工作流程

蛋白質(zhì)/肽從頭測(cè)序的工作流程如下：

1.使用生化分級(jí)分離或親和選擇過程從樣品組織中提取待分析的蛋白質(zhì)。 使用相關(guān)酶（酶解），如胰蛋白酶，生成肽。

2.使用高效液相色譜分離和純化肽消化產(chǎn)物。

3. 進(jìn)入離子源前，用高壓液相色譜分離洗滌肽段。

4. 肽通過離子源并轉(zhuǎn)化為帶高電荷的液滴。 脫水后進(jìn)入質(zhì)譜儀產(chǎn)生一級(jí)質(zhì)譜。

5. 肽段的優(yōu)先級(jí)列表由計(jì)算機(jī)生成。

6. 選擇肽段進(jìn)行下一輪碎裂。 通過檢測(cè)電磁場(chǎng)中的離子運(yùn)動(dòng)，可以得到離子的質(zhì)荷比，構(gòu)成串聯(lián)質(zhì)譜儀；

7、質(zhì)譜儀分析過程中，具有特定質(zhì)荷比的肽離子通過一定質(zhì)量數(shù)；

8、根據(jù)這些碎片離子的質(zhì)荷比信息，可以推導(dǎo)出這種能量轟擊裂解，通過排列組合推導(dǎo)出相應(yīng)的肽段氨基酸殘基，從而解析出相應(yīng)的肽段序列到質(zhì)譜；
9. 軟件用于分析每個(gè)肽的二級(jí)質(zhì)譜峰。 拼接肽段序列，獲得全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。

圖 1. 質(zhì)譜法肽從頭測(cè)序的過程（Hao, et al . 2019）。

圖 2. HPLC 與質(zhì)譜聯(lián)用的 de novo 測(cè)序過程

多肽和蛋白質(zhì)從頭測(cè)序的質(zhì)譜應(yīng)用

部分應(yīng)用包括生物樣品中未知肽序列的分析檢測(cè)、末端殘基缺失肽的檢測(cè)、賴氨酸和亮氨酸的鑒定、N-末端封閉和環(huán)狀蛋白的鑒定、未知蛋白質(zhì)或肽序列信息的準(zhǔn)確測(cè)定，以方便未知蛋白質(zhì)的功能研究，商業(yè)修飾蛋白質(zhì)和酶的序列的準(zhǔn)確測(cè)定，穩(wěn)定細(xì)胞系中表達(dá)的蛋白質(zhì)序列的準(zhǔn)確測(cè)定，抗體一級(jí)結(jié)構(gòu)序列的單克隆分析等。

目前，最常用的蛋白質(zhì)序列分析技術(shù)是質(zhì)譜法。質(zhì)譜法是一種用于準(zhǔn)確測(cè)定和表征蛋白質(zhì)的高效方法。蛋白質(zhì)經(jīng)過消化酶預(yù)處理后被消化成小碎片，然后通過質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。 根據(jù)項(xiàng)目需要，MALDI 和 ESI 是兩種用作電離肽片段的電離源。 通常，在處理大量樣本時(shí)，更頻繁地使用 MALDI。 然后通過分析每個(gè)片段的質(zhì)譜獲得肽序列，這些片段共同構(gòu)成全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列。

作為國(guó)內(nèi)領(lǐng)先的生物技術(shù)公司之一，輝駿生物專業(yè)提供準(zhǔn)確的質(zhì)量測(cè)定。 基于核磁共振和質(zhì)譜技術(shù)平臺(tái)，我們保證為客戶提供可靠高效的質(zhì)譜鑒定研究服務(wù)，以符合廣大客戶的研究目標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)交付：蛋白及肽段鑒定結(jié)果表、質(zhì)譜檢索網(wǎng)頁(yè)、指定肽段的質(zhì)譜圖、質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)、實(shí)驗(yàn)報(bào)告。我們的實(shí)驗(yàn)員在實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)處理方面擁有深厚的知識(shí)和豐富的經(jīng)驗(yàn)。 如果您有任何問題或具體要求，請(qǐng)撥打技術(shù)電話隨時(shí)與我們聯(lián)系：4006991663， 我們期待在未來與您合作！

參考
1. Aebersold R, Mann M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature, 2003,422(6928):198-207.
2. Hao Yang, Yan Chang Li, Ming Zhi Zhao, et al. Precision De Novo Peptide Sequencing Using Mirror Proteases of Ac-LysargiNase and Trypsin for Large-scale Proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP, 2019.
3. Medzihradszky K F, Chalkley R J. Lessons in de novo peptide sequencing by tandem mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews, 2013, 34(1).
4. Marshall Bern, Yuhan Cai, David Goldberg. Lookup Peaks: A Hybrid of de Novo Sequencing and Database Search for Protein Identification by Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, 2007, 79(4):1393-1400.