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DNA pull down是一種體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典技術(shù)。它通過(guò)特異性DNA序列捕獲并鑒定與之結(jié)合的蛋白，尤其適用于尋找基因啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子。

輝駿生物在本文將系統(tǒng)介紹DNA pulldown技術(shù)原理、實(shí)驗(yàn)流程、注意事項(xiàng)、結(jié)果解讀、文獻(xiàn)應(yīng)用及常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案，為您提供清晰實(shí)用的實(shí)驗(yàn)參考。

如有任何技術(shù)問(wèn)題或產(chǎn)品訂購(gòu)需求，歡迎隨時(shí)聯(lián)系我們：18927549347、13430303037（微信同號(hào)）。

DNA pull down是體外條件下研究目標(biāo)DNA片段與蛋白質(zhì)相互作用的重要技術(shù)。其基本原理是先體外制備帶有生物素標(biāo)記的DNA探針；之后，生物素DNA探針結(jié)合到鏈霉親和素磁珠上；再將DNA-Beads與細(xì)胞裂解液孵育，這樣DNA結(jié)合蛋白便一起吸附在Beads上；洗滌掉未結(jié)合的蛋白后，再用洗脫液將DNA結(jié)合蛋白從Beads洗脫下來(lái)，得到DNA pull down產(chǎn)物。

這種DNA-protein復(fù)合物既可以用Western Blot檢測(cè)已知的結(jié)合蛋白，還可以采用質(zhì)譜方法鑒定與目標(biāo)DNA結(jié)合的未知蛋白。

圖1 DNA pull-down實(shí)驗(yàn)原理圖

1、質(zhì)粒準(zhǔn)備

構(gòu)建含目的基因序列的質(zhì)粒，這是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，為后續(xù)的 PCR 擴(kuò)增提供模板，確保所研究的特定 DNA 序列能夠被準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增和操作，從而用于捕獲與之相互作用的蛋白質(zhì)。

注意：可同時(shí)構(gòu)建突變體質(zhì)粒（突變核心結(jié)合位點(diǎn)）作為陰性對(duì)照，排除非特異性結(jié)合干擾。

2、生物素標(biāo)記的DNA探針制備

根據(jù)目標(biāo) DNA 序列設(shè)計(jì)并合成生物素標(biāo)記的引物和未標(biāo)記的引物，以目的基因質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增分別得到生物素標(biāo)記的 DNA 探針（實(shí)驗(yàn)組）和未標(biāo)記的探針（對(duì)照組），用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行探針的回收純化。

3、蛋白樣本制備

3.1 總蛋白提取

(1)將兩組樣本（實(shí)驗(yàn)組+對(duì)照組）按照如下方法收集和處理：

圖3 DNA pull-down實(shí)驗(yàn)分組圖

3.2 核蛋白提取

如果提取核蛋白，需要自備核蛋白提取試劑盒，并按照說(shuō)明書(shū)操作。提取好的核蛋白取 30 μL 作為 input，剩余平分為兩份用于 DNA pull-down 實(shí)驗(yàn)（記為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組），置于冰上備用或- 80℃保存。

注意：提取核蛋白所需的樣本量約為總蛋白的兩倍，但具體使用量還需要根據(jù)實(shí)際操作來(lái)摸索；根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，樣本總蛋白濃度通常不低于 5 μg/μL，總量約 2~3 mg。

4、DNA pull-down

1. 3 μg 探針 + 鏈霉親和素磁珠（輝駿貨號(hào) FI8303），室溫混 30 min。  

2. 磁力架 1 min，棄上清。  

3. 500 μL 漂洗液顛倒 30 次，磁力架 1 min，棄液；再洗 1 次。  

4. 加對(duì)應(yīng)裂解液，4 ℃混 2–4 h。  

5. 磁力架 1 min，棄上清。

5、洗滌

(1) 每組加入 500 μL 漂洗液，顛倒混勻 30 次，放磁力架上靜置 1 min 并棄上清；

(2) 重復(fù)上步操作兩次，共漂洗三次，保留磁珠。

6、洗脫

6.1 非變性洗脫法

磁珠加50 μL洗脫液，渦旋20 s，室溫10–15 min，再渦旋20 s；1000 g 20 s，磁力架1 min，取上清，–80 ℃存，保持活性，可直接用于質(zhì)譜、WB等。

6.2 SDS-PAGE 上樣緩沖液洗脫法（變性洗脫法）

向磁珠中加入 50 μL 1×SDS-PAGE 上樣緩沖液，95 ℃加熱5 min；磁力架上靜置 1 min，收集上清至新的離心管中。該洗脫產(chǎn)物適用于 SDS-PAGE 或 Western Blot 檢測(cè)；如果需要進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，則切膠條后送檢。

注意：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，可選擇非變性洗脫法或變性洗脫法進(jìn)行洗脫；由于DNA pulldown 捕獲的蛋白量通常較少，建議將SDS-PAGE 膠用硝酸銀染色。

7、WB檢測(cè)是否存在靶蛋白/質(zhì)譜檢測(cè)洗脫液中的蛋白

PS：輝駿生物自有質(zhì)譜檢測(cè)平臺(tái)，擅長(zhǎng)IP、pull-down產(chǎn)物等微量蛋白的質(zhì)譜鑒定及生信分析

1.  DNA探針需經(jīng)電泳驗(yàn)證完整性。

2.  細(xì)胞或組織裂解應(yīng)充分、均勻，以保證蛋白完整與活性。

3.  洗滌步驟應(yīng)適度，避免過(guò)度洗脫特異性結(jié)合蛋白。

4.  選擇適宜的蛋白分析方法，以確保結(jié)合蛋白的準(zhǔn)確鑒定與定量。

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：篩選與目標(biāo) DNA 序列結(jié)合的蛋白質(zhì)

(1) 未標(biāo)記組：未標(biāo)記目標(biāo) DNA 探針的 pull-down 產(chǎn)物（對(duì)照組）；

(2) 標(biāo)記組：生物素標(biāo)記目標(biāo) DNA 探針的 pull-down 產(chǎn)物（實(shí)驗(yàn)組）。

圖5 DNA pull-down蛋白銀染圖

輝駿生物技術(shù)服務(wù)優(yōu)勢(shì)?：

• 一站式：探針設(shè)計(jì)→pull down→LC-MS/MS→生信分析，全程自建平臺(tái)。

• 高靈敏：10?12 mol 級(jí)蛋白檢出率＞95%，微量樣本（≥30 μg）即可開(kāi)工。

• 低背景：專利封閉磁珠（貨號(hào) FI8303）+ 嚴(yán)苛漂洗體系，非特異 <5%

• ?文獻(xiàn)級(jí)成果?：眾多DNA pulldown客戶服務(wù)案例發(fā)表于高影響力期刊，助力疾病機(jī)制研究。

  
  

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1、DNA pull-down產(chǎn)品