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純化的 RNA 樣本是當(dāng)今許多廣泛使用的檢測(cè)的重要起點(diǎn)，從 RT-qPCR 到下一代測(cè)序。  雖然從細(xì)胞樣本中提取和純化 RNA 的主要方法只有三種，但在分離 RNA 時(shí)，有無(wú)數(shù)注意事項(xiàng)可以幫助您優(yōu)化工作流程。  輝駿生物在本文列舉了一些純化高質(zhì)量 RNA 的方法技巧，以提高您對(duì)后續(xù)檢測(cè)結(jié)果的信心。

RNA提取純化的主要方法

雖然提取方法的選擇有時(shí)取決于樣品類型，但通常這三種方法可用于大多數(shù)樣品。  即使是更難裂解和提取 RNA 的細(xì)胞類型，如細(xì)菌、植物和酵母，也可以使用額外的裂解步驟成功提取。

1.苯酚/氯仿法

這是最古老、久經(jīng)考驗(yàn)的提取 RNA 的方法。   它使用簡(jiǎn)單但費(fèi)力的方案，該方案依賴于分子種類在有機(jī)溶劑和水中的不同溶解度。  苯酚/氯仿方法可以容納更大的樣品，但它的整體性較低且不易自動(dòng)化。孵育時(shí)間和沉淀溫度很重要，他使用低溫來(lái)保護(hù) RNA 免受 RNA 酶的降解。 應(yīng)注意不要干擾過(guò)程中形成的相[以防止 DNA 或蛋白質(zhì)污染 RNA，因此需要良好的處理能力，苯酚/氯仿方法通常會(huì)產(chǎn)生更清潔的 RNA，并允許從較少量的細(xì)胞中提取 RNA與下面的離心柱方法相比。

2.自旋柱/柱色譜法

離心柱方法使用包含硅膠過(guò)濾柱的小型離心管。  用 RNase 抑制劑和高鹽濃度處理的裂解樣品在離心過(guò)程中通過(guò)離心柱，而 RNA 仍然與柱內(nèi)的二氧化硅結(jié)合。  洗滌去除雜質(zhì)，然后用水從硅膠過(guò)濾器中洗脫純化的 RNA。

離心柱以方便的試劑盒形式廣泛使用，通常使用簡(jiǎn)單、快速的方案。  但這可能會(huì)因樣品裂解或均質(zhì)化不完全或過(guò)濾器過(guò)載而變得復(fù)雜。使用適量的輸入材料很重要，因?yàn)槭褂眠^(guò)多的樣品可能會(huì)降低裂解效率，引入過(guò)量的 RNA 以外的細(xì)胞成分，并損害 RNA 與 RNA 純化柱的結(jié)合。自動(dòng)化是可能的，但不如自動(dòng)化磁珠方法方便。

離心柱法僅適用于小樣本，但可以使用各種樹(shù)脂通過(guò)柱層析純化大量的 RNA（例如克到千克）。  純化工作流程中最重要的一步是優(yōu)化上樣和洗脫步驟以獲得最佳容量和產(chǎn)量，同時(shí)保持高純度。

通過(guò)柱層析純化 mRNA 時(shí)，優(yōu)化鹽濃度尤為重要。在較高的鹽濃度下，mRNA 可以沉淀或形成更高級(jí)的結(jié)構(gòu)，如 dsRNA。在為 oligo(dT) 親和力柱制定加載方案時(shí)，首先確定 mRNA 沉淀或形成雙鏈的鹽濃度是有幫助的，因?yàn)榈陀诖藵舛鹊募虞d有助于恢復(fù)和純度。與 oligo(dT) 結(jié)合所需的鹽含量與需要中和的核苷酸數(shù)量有關(guān)。

3.磁珠法

該方法使用涂有二氧化硅或其他結(jié)合 RNA 的配體（例如 oligo(dT)）的磁珠來(lái)分離具有完整 polyA 尾巴的 mRNA 分子。將珠子與細(xì)胞裂解物和 RNase 抑制劑一起孵育，然后使用磁場(chǎng)將其固定到位，同時(shí)去除上清液（含有不需要的碎片和雜質(zhì)），并洗滌珠子以去除殘留的雜質(zhì)。 將珠子重新懸浮在水中會(huì)洗脫純化的 RNA。

這是一個(gè)快速、簡(jiǎn)單的協(xié)議，易于自動(dòng)化進(jìn)行高通量工作。  沒(méi)有過(guò)濾器柱消除了對(duì)過(guò)濾器堵塞或過(guò)載的擔(dān)憂。  更粘稠的樣品可能會(huì)帶來(lái)挑戰(zhàn)，因?yàn)樵诜跤^(guò)程中珠子和 RNA 可能更難以接觸。