研究蛋白質(zhì)相對定量的蛋白質(zhì)組學(xué)方法

差異蛋白表達(dá)的測量為檢測細(xì)胞的整體變化提供了一種直接而準(zhǔn)確的方法。定量蛋白質(zhì)組學(xué)對于發(fā)現(xiàn)診斷或預(yù)后蛋白標(biāo)志物、檢測新的治療靶點(diǎn)以及了解基本的生物學(xué)過程和機(jī)制具有重要意義。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，我們可以利用更可靠和動態(tài)的方法來分析蛋白質(zhì)的差異表達(dá)。

定量蛋白質(zhì)組學(xué)可分為相對定量和絕對定量。相對定量是研究不同情況下蛋白質(zhì)組表達(dá)的差異，主要方法有穩(wěn)定同位素標(biāo)記和無標(biāo)記定量。絕對定量是獲得蛋白質(zhì)的特定表達(dá)水平。以下是相對定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的一些技術(shù)。

代謝標(biāo)記需要在富含培養(yǎng)基的穩(wěn)定同位素中培養(yǎng)樣品。 SILAC（細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記）依賴于將特定“輕”或“重”形式的氨基酸代謝結(jié)合到蛋白質(zhì)中。經(jīng)過多次細(xì)胞分裂后，蛋白質(zhì)被穩(wěn)定同位素標(biāo)記。來自“輕”和“重”培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)可以通過質(zhì)譜一起分析。由于質(zhì)量差異，質(zhì)譜中根據(jù)這兩種肽的面積進(jìn)行相對定量。目前常用的有亮氨酸、精氨酸、賴氨酸等氨基酸。

圖 1. SILAC 的工作流程

除了定量蛋白質(zhì)的研究外，SILAC技術(shù)還用于翻譯后修飾蛋白質(zhì)的鑒定和修飾，以及蛋白質(zhì)的相互作用。該技術(shù)在處理前引入標(biāo)簽，因此誤差小，重現(xiàn)性好。然而，SILAC只適用于細(xì)胞樣本，而且由于培養(yǎng)細(xì)胞需要很長時間。

2. 化學(xué)標(biāo)簽——iTRAQ

引入同位素在體外，適用于細(xì)胞、體液、組織等樣品。有幾種代表性方法，例如用于相對和絕對定量的等壓標(biāo)簽 (iTRAQ) 標(biāo)記肽 N 端氨基，酯化標(biāo)記標(biāo)記肽 C 端羧基 (-COOH)，ICAT 用于半胱氨酸硫醇 (-SH) 和很快。以下重點(diǎn)介紹 iTRAQ。 iTRAQ實(shí)驗(yàn)非常適合比較不同處理中的樣品、生物復(fù)制并提供相對定量。

圖 2. iTRAQ 的工作流程

iTRAQ標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)由Applied Biosystems Incorporation 開發(fā)，是一種利用多重等壓化學(xué)標(biāo)記試劑的技術(shù)。該試劑由報告基團(tuán)、平衡基團(tuán)和肽反應(yīng)基團(tuán)組成。肽反應(yīng)基團(tuán)將 iTRAQ Reagent 同量異位標(biāo)簽與肽的每個賴氨酸側(cè)鏈和 N 末端基團(tuán)共價連接，標(biāo)記給定樣品消化物中的所有肽。在 MS/MS 圖中，不同樣品標(biāo)記中的相同蛋白質(zhì)表現(xiàn)出相同的質(zhì)荷比。通過比較 MS/MS 報告離子的峰面積和所得峰比來實(shí)現(xiàn)定量。

3. 無標(biāo)簽

無標(biāo)記定量技術(shù)可以確定兩個或多個樣品中蛋白質(zhì)的相對量。無標(biāo)記定量不會將穩(wěn)定同位素引入蛋白質(zhì)，這與其他蛋白質(zhì)定量方法不同。

無標(biāo)記定量技術(shù)通常有兩種方式。定量值可以通過提取母離子色譜峰的面積——曲線下面積 (AUC) 或 MS1 信號強(qiáng)度方法來測量。第二個是基于分配給給定蛋白質(zhì)的光譜數(shù)，稱為光譜計數(shù)。在光譜計數(shù)方法中，來自同一蛋白質(zhì)的已識別 MS/MS 光譜的數(shù)量與蛋白質(zhì)豐度直接相關(guān)。一般來說，樣品中蛋白質(zhì)的豐度越高，通過切割產(chǎn)生的肽就越多。并且消化產(chǎn)生的肽越多，質(zhì)譜鑒定出的唯一匹配肽就越多，對應(yīng)的光譜數(shù)量也就越多。

蛋白質(zhì)組學(xué)是對細(xì)胞或組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)的系統(tǒng)分析，質(zhì)譜是必不可少的分析工具。質(zhì)譜法可用于檢測細(xì)胞或組織中對外部或內(nèi)部干擾作出反應(yīng)的蛋白質(zhì)組的變化，稱為定量蛋白質(zhì)組學(xué)。

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* 基于SILAC的蛋白質(zhì)組學(xué) 分析服務(wù)

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