在過去的幾十年中，定量蛋白質組學一直是生物學研究中的一個前沿且要求很高的領域。  隨著技術的進步，基于 MS（質譜）的方法已成為非常有用的工具，它利用碎片化合物的質荷比與其離子豐度成比例。  MS 將結果作為化合物的離子豐度與其質荷比的關系圖提供，隨后提供有關化合物的性質、可能的結構和性質的信息。   這種化合物可以是任何蛋白質、翻譯后修飾、生物活性分子等。蛋白水解肽的 MS 響應可能由于其不均勻的物理化學性質（例如疏水性、偶極矩、大小、電荷、質量等）而有所不同。因此它成為一種劇烈運動以準確量化同一 MS 分析中不同測試樣品之間生物分子相對豐度的變化。  為了解決這個缺陷，在通用 MS 協(xié)議中引入了一種新的修改，稱為 SILAC（細胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標記），它允許將氨基酸的穩(wěn)定同位素插入蛋白質或肽中。  SILAC 能夠在同一 MS 運行中對來自不同測試樣品的這些分子進行相對和可比較的量化，最終最大限度地減少由 MS 儀器在不同運行中造成的樣品注入和離子抑制導致的結果的錯誤變異性。

SILAC實驗技術于2002 年首次引入，作為南丹麥大學實驗生物信息學中心 (CEBI) 的一種代謝標記技術。  準確地說，在活細胞的生長培養(yǎng)基中使用了穩(wěn)定的同位素標記的氨基酸，隨后可以對不同實驗條件下的細胞蛋白質組學進行廣泛比較。

SILAC實驗的原則

SILAC 主要基于穩(wěn)定同位素標記的氨基酸（例如含有 13 C 或 15 N 的精氨酸或賴氨酸）在活細胞培養(yǎng)物中的代謝結合。 有兩種細胞群被選擇并在兩種不同的培養(yǎng)基中生長； 一個群體的“輕培養(yǎng)基”基本上包含含有天然同位素的氨基酸，而另一個群體則用包含穩(wěn)定同位素標記的氨基酸的“重培養(yǎng)基”喂養(yǎng)。

SILAC 背后的關鍵原理是隨著細胞分裂次數(shù)的增加代謝活動增加，隨后氨基酸在蛋白質組中的摻入增加。 隨著分裂次數(shù)的增加，蛋白質達到重狀態(tài)，所有蛋白質都含有標記的氨基酸。 雖然，標記效率會根據(jù)蛋白質周轉率（蛋白質合成與降解）進行預先優(yōu)化。 在確保完全標記（等于或 > 95% 的標記效率）后，可以對細胞群進行操作，然后從等量的標記和未標記細胞群中提取總蛋白質。 將蛋白質樣品探測到基于胰蛋白酶的消化形成肽。 最終，消化的肽可以在 LC-MS/MS 儀器上進行分析。 結果的量化基于同位素標記肽與未標記肽的比率。 來自標記和未標記樣品的信號強度允許進行定量比較。

對于進行 SILAC 實驗，氨基酸的選擇非常關鍵。  在理想條件下，這些氨基酸應該是培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞存活所必需的一種氨基酸，以確保所選氨基酸的唯一來源來自培養(yǎng)基，例如亮氨酸、賴氨酸和蛋氨酸。

如今， 13 C 或 15 N 標記的精氨酸和賴氨酸的組合用于重培養(yǎng)基中，因為在下一步蛋白質組學分析中使用的蛋白水解酶胰蛋白酶在賴氨酸和精氨酸殘基的羧基末端特異性切割。因此，SILAC 標記與重賴氨酸和精氨酸的組合以及胰蛋白酶消化的組合提供了對蛋白質中除 C 端以外的大多數(shù)胰蛋白酶肽的更大程度的定量，最終達到更高的蛋白質組定量效率。

SILAC實驗多重比較水平

SILAC 實驗可以通過兩個或多個比較級別（plex）進行。  大多數(shù)實驗比較了兩種不同的細胞條件。  然而，隨著精氨酸和賴氨酸三種同位素不同形式的可用性，也可以進行三個級別的比較。最近，由于多級比較的廣泛優(yōu)勢，5-plex SILAC 實驗可用于五種同位素不同形式的精氨酸。  盡管 5-plex 系統(tǒng)的缺點是影響了蛋白質組的量化效率，因為只有含精氨酸的肽才能用它來量化。  為了克服這個問題，可以在相同的測試條件下進行兩個 3-plex SILAC 標記。

SILAC技術實驗流程-輝駿生物

SILAC技術實驗服務信息-輝駿生物

SILAC定量蛋白質組學實驗技術-輝駿服務優(yōu)勢

1

近十年服務經(jīng)驗，眾多服務案例，服務成果得到優(yōu)秀期刊認可

2

對蛋白篩選與定量方面有獨到見解，擅長針對客戶情況提出合適的方案建議

3

自有分子及細胞生物實驗平臺，能有效制定并執(zhí)行最優(yōu)的實驗路線

4

售后技術支持將一直保持到客戶發(fā)表文章，確?？蛻舭残倪M行下游實驗及投稿

SILAC實驗-輝駿生物客戶文獻

輝駿實力